PRÁCTICA 8: DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS ANTI-TREPONEMA PALLIDUM

OBJETIVO:

Determinar mediante el método cualitativo y semicuantitativo la existencia de aglutinación de anticuerpos anti-Treponema pallidum.

PRINCIPIO DEL MÉTODO:

Es una prueba de hemoaglutinación indirecta en microplaca para la detección cualitativa y semicuantitativa de anticuerpos específicos anti-Treponema pallidum en suero humano. Los hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con una solución antigénica de T.pallidum, aglutinan en presencia de anticuerpos anti-T.pallidum mostrando unos patrones de aglutinación característicos.

SIGNIFICADO CLÍNICO:

La sífilis es una enfermedad venérea provocada por la infección con T.pallidum. La transmisión del microorganismo se produce por contacto directo a través de una lesión productiva. El periodo de incubación es aproximadamente de 20 días y la enfermedad progresa a través de 3 fases distintas con sintomatología diferente. Los anticuerpos anti-Treponema aparecen a partir de la primera fase y pueden permanecer en un 85-90% de pacientes tratados a pesar de haber superado la enfermedad.

REACTIVOS:

- R1: Células Test (hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con antígenos de T.pallidum)

- R2: Células Control (suspensión estabilizada de hematíes de ave)

- R3: Diluyente (tampón fosfato, extracto de T.pallidum)

- Control + (suero inmune humano prediluido 1:20)

- Control - (suero de animal)

MATERIAL:

- Placas de microtitulación con fondo en "U"

- Pipetas de 20-200 uL

- Puntas amarillas

- Vaso de precipitados (desechos)

MUESTRAS:

- Suero fresco o plasma

PROCEDIMIENTO:

Método cualitativo

1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.

2. Pipetear en pocillos adyacentes de una placa de microtitulación:

- Muestra 1/20 o Controles (uL)               25           25

- Células Control (uL)                               75           --

- Células Test (uL)                                    --            75

3. Agitar suavemente la placa hasta la completa homogeneización de las mezclas.

4. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 45-60 min.

5. Examinar macroscópicamente los patrones de aglutinación de las células.

Método semicuantitativo

1. Realizar diluciones dobles a partir de la dilución 1:20 de la muestra en Diluyente.

2. Ensayar cada dilución con 25 uL de diluyente en cada pocillo (4 pocillos), y en el primer pocillo depositar 25 uL de muestra.

3. Al final de las diluciones depositar 75 uL de células test.

RESULTADOS:

- Si forma velo es positivo.

- Si forma anillo es negativo.

- Observamos en la primera fila, correspondiente al método cuantitativo, que el resultado sale positivo.

- En la fila de abajo, correspondiente al método semicuatitativo, la titulación sería 1/80.

OBSERVACIONES:

- No se puede dejar sin observar los resultados de la placa más de 30 minutos, pues los resultados salen erróneos.

- Realizamos en la primera fila de la placa el método cualitativo, y en la segunda fila el método semicuantitativo.