PRÁCTICA 3: DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE PROTEÍNA C-REACTIVA (PCR)

PRINCIPIO DEL MÉTODO:

La PCR-Látex es una técnica de aglutinación en porta para la detección cualitativa y semicuantitativa de PCR en suero humano. Las partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti-PCR humana son aglutinadas por moléculas de PCR presentes en la muestra del paciente.

SIGNIFICADO CLÍNICO:

La Proteína C-reactiva es una proteína de fase aguda, presente en el suero de pacientes sanos, la cual puede incrementarse significativamente en la mayoría de procesos infecciosos bacterianos y virales, tejidos dañados, inflamación y neoplasias malignas. El incremento de concentración de esta proteína se produce después de unas horas de desarrollarse la inflamación pudiendo alcanzar niveles de 300 mg/L en 12-24 horas.

REACTIVOS:

• Látex: Suspensión de partículas de látex cubiertas de IgG de cabra anti-PCR humana, pH 8,2. Conservante.
• Control +: Suero humano con una concentración de PCR > 20 mg/L. Conservante.
• Control -: Suero animal. Conservante.

PRECAUCIONES:
Todos los componentes de origen humano han resultado ser negativos para el antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV (1/2). Sin embargo, deben tratarse con precaución como potencialmente infecciosos.

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD:

Todos los componentes del kit están listos para el uso, y son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, y se evita la contaminación durante su uso. No congelar: la congelación de los reactivos altera irreversiblemente la funcionalidad de éstos.

Conservar los viales siempre en posición vertical. En caso de cambio de posición agitar hasta la disolución de posibles agregados.

MATERIAL ADICIONAL:

- Agitador mecánico rotatorio de velocidad regulable a 80-100 r.p.m

- Agitador vortex

- Pipetas de 50 μL

- Puntas de pipeta

- Vaso para desechos

- Tarjeta.
- Guantes y bata

MUESTRAS:

Suero fresco. Estable 7 días a 2-8ºC o 3 meses a -20ºC.

Las muestras con restos de fibrina deben ser centrifugadas antes de la prueba.
No utilizar muestras altamente hemolizadas o lipémicas.

PROCEDIMIENTO: 

- Método cualitativo

1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.
2. Depositar 50 μL de la muestra (Nota 1) a ensayar y una gota de cada uno de los controles Positivo y Negativo, sobre círculos distintos de un porta.
3. Mezclar el reactivo de PCR- látex vigorosamente o con el agitador vortex antes de usar. Depositar una gota (50 μL) junto a cada una de las gotas anteriores.
4. Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo. Emplear palillos distintos para cada muestra.
5. Situar el porta sobre un agitador rotatorio a 80 – 100 r.p.m. y agitar durante 2 minutos. El exceso de tiempo puede originar la aparición de falsos positivos.

- Método semicuantitativo

1. Realizar diluciones dobles de la muestra en solución salina 9 g/L. 
2. Proceder para cada dilución, como en la prueba cualitativa.

LECTURA E INTERPRETACIÓN:

Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación inmediatamente después de retirar el porta del agitador. La presencia de aglutinación indica una concentración de PCR igual o superior a 6 mg/L (Nota 2 y 3).

En el método semicuantitativo, se define el título como la dilución mayor que da resultado positivo. 

RESULTADOS:

Titulación 1/4

CÁLCULOS:

La concentración aproximada de PCR en la muestra del paciente se obtiene aplicando la siguiente fórmula: 6 x Título de PCR = mg/L

CONTROL DE CALIDAD:

Se recomienda utilizar el control positivo y negativo para controlar la funcionalidad del reactivo de látex, así como modelo de comparación para la interpretación de los resultados.

Todo resultado distinto al resultado que da el control negativo, se considerará positivo.

VALORES DE REFERENCIA:

Hasta 6 mg/L. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

INTERFERENCIAS:

Bilirrubina (20 mg/dL), hemoglobina (10 g/L) y los lípidos (10 g/L) no interfieren. Factores reumatoides (100 UI/mL), interfieren. Otras sustancias pueden interferir.

NOTAS:

1. Una concentración muy elevada de PCR en la muestra del paciente puede dar lugar a un resultado falsamente negativo debido al efecto prozona. Se recomienda re-ensayar la muestra utilizando un volumen de 20 μL.
2. La intensidad de la aglutinación no es indicativa de la concentración de PCR en las muestras ensayadas.
3. El diagnóstico clínico no debe realizarse únicamente con los resultados de un único ensayo, sino que debe considerarse al mismo tiempo los datos clínicos del paciente.

OBSERVACIONES:
- No mezclar las puntas de pipeta o palillos, para mezclar, o en su caso realizar las diluciones. Esto puede alterar la práctica.

IMÁGENES DE LA PRÁCTICA:

Control positivo