PRÁCTICA 14: RUBEÓLA Ig G ELISA

OBJETIVO:

Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de anticuerpos IgG contra vIrus de la rubéola en suero y plasma humanos.

FUNDAMENTO:

El inmunoensayo enzimático sobre fase sólida (ELISA) está basado en el principio del sandwich. Los pocillos están recubiertos con un antígeno. Los anticuerpos específicos de la muestra que se unen a los pocillos recubiertos con el antígeno son detectados por un conjugado enzimático del segundo anticuerpo específico para el antígeno humano IgG. La intensidad del color desarrollado por la reacción del substrato es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos IgG detectados. Los resultados de las muestras se pueden determinar directamente usando la curva estándar.

MUESTRA:

Suero o plasma (diluir con el diluyente 1/101)

Diluyente

Rubeóla

Muestra diluida (rubéola+diluyente)

COMPONENTES DEL KIT:

- Microtiras de Ig G recubiertas de antígeno de rubeóla.

- Calibradores: suero humano diluido con PBS: a) 0 b) 10 c) 50 d) 200 e)500 U/I/mL (listos para usar)

- Conjugado de Ig G antihumano 15 mL anticuerpos Ig G de conejo (listos para usar)

- Sustrato (listos para usar)

- Solución de parada (listos para usar)

- Solución diluyente para la muestra

- Solución de lavado 10X

MATERIAL:

- Gradillas

- Pipeta automática 100 uL/1000 uL y de 5 uL

- Puntas amarillas y azules

- Papel de filtro
- Parafilm 

PROCEDIMIENTO:

Preparación de los reactivos (solución de lavado, diluir antes de usar 1/9 con agua destilada (9).

Técnica

1. Preparar un pocillo para sustrato blanco (poner al principio), 5 pocillos para los calibradores, pocillos para las muestras.

2. Pipetear 100 uL en cada pocillo de calibradores, y en el 7º pocillo colocar 100 uL de muestra (diluida 1/101). Dejar el 1º pocillo para el blanco.

3. Preparar muestra: echar en un eppendorf 500 uL de diluyente y 5 uL de muestra de rubéola.

POCILLO 1	POCILLO 2	POCILLO 3	POCILLO 4	POCILLO 5	POCILLO 6	POCILLO 7
Nada 0 UI/mL	Calibrador A	Calibrador B	Calibrador C	Calibrador D	Calibrador E	MUESTTRA 100 uL (1/101)

4. Tapar la placa e incubar a temperatura ambiente 1 hora.

5. Después de incubar, aspirar o volcar. Lavar 3 veces con 300 uL de solución de lavado.

6. Evitar rebosar los pocillos cuando lavamos y sin mezclar, usando puntas de pipeta diferentes.

7. Pipetear 100 uL de conjugado anti-Ig G con excepción del blanco. 

8. Tapar e incubar 30 minutos a temperatura ambiente.

9. Repetir el paso 4.

10. Pipetear 100 uL de sustrato en todos los pocillos, incluido el blanco.

11. Tapar e incubar 20 minutos en la oscuridad.

12. Pipetear 100 uL de solución de parada, incluir el blanco.

13. Medir la absorción a 450 o 620 nm. Es estable durante 60 minutos.

MEDICIÓN: Curva de calibración

1. Efectuar con el blanco del pocillo A1-A1 la calibración a 0 con el lector ELISA.

2. Medir la absorbancia a 450 0 620 nm, anotar los resultados de los controles y de la muestra (echar foto).

3. Si la calibración a 0 no es posible automáticamente, restar el valor del pocillo blanco al resto.

Cálculo del valor de la medición

Para obtener resultados de medidas internaciones/mL se realiza una curva de calibración, con la absorbancias en el eje Y y las concentraciones de los  calibradores en el eje X.

RESULTADO: