OBJETIVO:
TOXO-HAI FUMOUZE permite la determinación cuantitativa de anticuerpos serios dirigidos contra Toxoplasma gondii por hemoaglutinación indirecta.
FUNDAMENTO:
Se basa en el principio de la hemoaglutinacion indirecta. Los hematíes sensibilizados están constituidos por hematíes de ovino recubiertos por un antígeno toxoplasmático. Esta técnica permite detectar las IgG y las IgM anti-toxoplasmáticas. Es posible diferenciarlos tratando el suero con 2-mercaptoetanol (2-ME) el cual inhibe el poder aglutinante de las IgM.
La presencia de anticuerpos anti-Toxoplasma gondii serios provoca una aglutinación de los hematíes sensibilizados que se traduce en un velo rojo/marrón que tapiza el pocillo. En ausencia de anticuerpos específicos, estos hematíes se sedimentan en el fondo del pocillo como un anillo.
Los hematíes no sensibilizados aseguran la especificidad de la reacción y permiten eliminar las interferencias debidas a las aglutininas naturales anti-ovino (heteroanticuerpos de Forssman, anticuerpos de la mononucleosis infecciosa...).
La reacción se efectúa en microplaca con fondo en U.
La manipulación es simple y rápida. Los resultados se obtienen en 2 horas.
COMPOSICIÓN DEL EQUIPO:
- Hematíes sensibilizados (origen animal)
- Hematíes no sensibilizados (origen animal)
- Tampón fosfato pH 7,2
- Adsorbente (origen animal)
- Control positivo titulado (origen animal)
- Control negativo (origen animal)
- 2 microplacas con fondo en U
- 2 cuenta-gotas especiales para dispensar alrededor de 16 uL
- Instrucciones de uso
MATERIAL:
- Micropipeta multicanal para dispensar 50 uL
- Micropipeta para dispensar 50 uL, micropipeta 100-1000 uL
- Contenedor para desechos contaminados
- Tubos para hemólisis
- Centrífuga
- 2-mercaptoetanol (2-ME)
PROCEDIMIENTO:
Dejar que los reactivos y los sueros alcancen la temperatura ambiente antes de su uso.
I. ANÁLISIS DE LAS INMUNOGLOBULINAS TOTALES
1. Preparación de una dilución madre del suero a analizar (1/40).
Distribuir en un tubo para hemólisis y mezclar:
- 50 uL de suero
- 1,95 mL de tampón fosfato
2. Realización de la prueba en microplaca
a. Con la ayuda de una micropipeta, dispensar 50 uL de tampón fosfato en 8 pocillos de la microplaca.
b. Dispensar 50 uL de la dilución madre de suero en el pocillo 1.
Mezclar con el tampón y transferir, preferentemente con la ayuda de un micro-dilutor, 50 uL del 1er pocillo al 2º, del 2º al 3º, y así sucesivamente hasta el 6º pocillo, descartando 50 uL del 6º pocillo.
Se obtienen las siguientes diluciones:
c. Dispensar 50 uL de la dilución madre de suero en el 7º pocillo.
Mezclar con el tampón y descartar 50 uL.
Esta dilución (1/80) constituye el suero control, cuyo papel es detectar las aglutininas naturales anti-ovino que pueden contener ciertos sueros.
d. Agitar cuidadosamente las suspensiones de hematíes.
- Depositar 1 gota de hematíes sensibilizados en los 6 primeros pocillos.
- Depositar 1 gota de hematíes no sensibilizados en el 7º pocillo (suero control).
- Depositar 1 gota de hematíes sensibilizados en el 8º pocillo (reactivo control) cuyo papel es controlar la validez del tampón y de los hematíes sensibilizados.
Homogeneizar muy cuidadosamente el contenido de los pocillos:
- bien sea manualmente. golpeando lateralmente la microplaca, manteniéndola plana.
- bien con la ayuda de un agitador para placas de microtitulacion (por ejemplo 1.300 revoluciones/minuto durante 10 segundos).
Leer la reacción 2 horas más tarde.
RESULTADOS:
Titulación 1.280, queriendo decir esto que hasta el 5º pocillo la prueba resultaba positiva ya que había presencia del velo rojo/marrón tapizando el pocillo.
A partir del 6ª pocillo resultaba negativo.
OBSERVACIONES:
- Agitar cuidadosamente las suspensiones de hematíes antes del uso.
- No preparar más que un único reactivo control para cada serie de pruebas.
- No utilizar un un agitador orbital.
- No se hizo tratamiento con 2-Mercaptoetanol.
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