PRÁCTICA 10: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE INMUNOGLOBULINA M (IgM)

OBJETIVO:

Cuantificar la IgM en suero o plasma humano por el método de inmunoturbidimetría. 

PRINCIPIO DEL MÉTODO:

Los anticuerpos anti-IgM forman compuestos insolubles cuando se combinan con la IgM de la muestra del paciente, ocasionando un cambio de absorbancia proporcional a la concentración de IgM en la muestra, y que puede ser cuantificada por comparación con un calibrador de IgM de concentración conocida.

SIGNIFICADO CLÍNICO:

La IgM es la única inmunoglobulina que sintetiza el recién nacido. En adultos representa el 5-10% del total de inmunoglobulina. Su estructura pentamérica y su elevado peso molecular evita su paso a espacios extravascuslares.

Su concentración se halla disminuida en enfermedades relacionadas con deficiencias hereditarias o adquiridas de la producción de inmunoglobulinas. 

La respuesta normal a las infecciones consiste en aumentar la producción de inmunoglobulina. La IgM generalmente aumenta en infecciones líricas e infecciones del torrente circulatorio como la malaria y la cirrosis biliar primaria. En caso de mieloma múltiple, si la paraproteína es una IgM probablemente se trata de una macroglobulinemia de Waldenström. Las crioglobulinemias de origen monoclonal, son generalmente debidas a IgM.

APARATAJE:

- Espectrofotómetro

REACTIVOS:
- Diluyente R1

- Anticuerpo R2

- Calibrador o Patrón: PROT CAL

- ClNa 9 g/L 

MUESTRA:
- Suero o plasma fresco, recogido con heparina o EDTA como anticoagulantes

MATERIAL:
- Pipetas automáticas de 100-1000 uL y de 10 uL

- Puntas amarillas y azules

- Gradilla
- Tubos de ensayo de 3 mL 

- Cubetas de espectrofotometría 
- Vaso desechos

PREPARACIÓN:

En primer lugar se realizan las diluciones del Calibrador PROT CAL en ClNa 9 g/L como diluyente. Para obtener las concentraciones de cada dilución de IgM, multiplicar la concentración de IgM del calibrador por el factor correspondiente indicado en la tabla:

PROCEDIMIENTO:

1. Calentar los reactivos y encender el espectrofotómetro.

2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.

3. Pipetear en una cubeta o tubo de ensayo:

- Reactivo R1 (Diluyente): 800 uL + Muestra o calibrador: 10 uL

4. Mezclar y medir la absorbancia (A1), después de la adición de la muestra.

5. Inmediatamente después, pipetear en la cubeta:

- Reactivo R2: 200 uL

6. Mezclar y leer la absorbancia (A2) exactamente después de 2 minutos de añadir el Reactivo R2.

7. Debemos calcular la diferencia de absorbancias (A2-A1) obtenidas por los distintos calibradores, y construir la curva de calibración de los valores obtenidos frente a las concentraciones de IgM de cada dilución del Calibrador. La concentración de IgM en la muestra se calcula por interpolación de su diferencia (A2-A1) en la curva de calibración.

8. Ahora en un tubo de ensayo: suero (10 uL) +  Reactivo R1 (800 uL)

9. Medir la absorbancia (A1)

10. Echar inmediatamente después Reactivo R2 (200 uL), y medir absorbancia (A2).

RESULTADO:

La concentración resultado del Calibrador es de 259 mg/dL

- A1 (muestra con suero): 0,319

- A2 (muestra con suero): 0,565

Restamos A2-A1: 0,246

Hacemos la curva de calibración con los datos obtenido de la tabla y extrapolamos nuestro resultado de la muestra con suero a la recta.

OBSERVACIONES:

- Debemos ser precisos en el pipeteo.

- Para medir la Absorbancia 2, debe ser inmediatamente antes de 2 minutos del pipeteo pues el resultado a medir puede variar.