PRÁCTICA 11: DETERMINACIÓN DEL TÍTULO ANTI-SLO

OBJETIVO:

El objetivo de está practica es la realización de una inhibición de la hemaglutinación para determinar el título de antiestreptolisina O.

PRINCIPIO:

El carácter inmunogénico de la SLO permite valorar la extensión de una infección estreptocócica, por simple titulación del nivel en suero de anticuerpos anti-SLO. Diluciones crecientes del suero problema se enfrentan con una cantidad constante de SLO, en presencia de una suspensión de hematíes, determinándose la dilución de suero más alta capaz de inhibir el poder hemofílico de la toxina. La inversa de dicha dilución corresponde al título del suero.

REACTIVOS:
- Tampón

- Suspensión de hematíes

- SLO

APARATAJE:
- Estufa de incubación

MATERIAL:
- Pipetas automáticas 50 uL/20-200uL
- Puntas amarillas
- Gradillas para Eppendorf

- Placa en forma de U

- Parafilm

MUESTRA:
- Suero 1/25

- Suero 1/10

PROCEDIMIENTO (MICROMÉTODO):
A) Diluciones del suero:
- Preparar las siguientes diluciones del suero del paciente:
0,2 ml suero+1,8 ml tampón (1:10)
0,1 ml suero+2,4 ml tampón (1:25)

A parir de aquí, proceder del siguiente modo:

RESULTADOS:
El título de antiestreptolisina O corresponde a la inversa de la mayor dilución en cuyo tubo no se detecta una hemólisis (velo).
- Hematíes debe aparecer libre de hemólisis (botón).

- Estreptolisina O debe presentar una hemólisis evidente.

- Fila A: El título sería 80.

- Fila B: El título sería 200.

PRÁCTICA 10: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE INMUNOGLOBULINA M (IgM)

OBJETIVO:

Cuantificar la IgM en suero o plasma humano por el método de inmunoturbidimetría. 

PRINCIPIO DEL MÉTODO:

Los anticuerpos anti-IgM forman compuestos insolubles cuando se combinan con la IgM de la muestra del paciente, ocasionando un cambio de absorbancia proporcional a la concentración de IgM en la muestra, y que puede ser cuantificada por comparación con un calibrador de IgM de concentración conocida.

SIGNIFICADO CLÍNICO:

La IgM es la única inmunoglobulina que sintetiza el recién nacido. En adultos representa el 5-10% del total de inmunoglobulina. Su estructura pentamérica y su elevado peso molecular evita su paso a espacios extravascuslares.

Su concentración se halla disminuida en enfermedades relacionadas con deficiencias hereditarias o adquiridas de la producción de inmunoglobulinas. 

La respuesta normal a las infecciones consiste en aumentar la producción de inmunoglobulina. La IgM generalmente aumenta en infecciones líricas e infecciones del torrente circulatorio como la malaria y la cirrosis biliar primaria. En caso de mieloma múltiple, si la paraproteína es una IgM probablemente se trata de una macroglobulinemia de Waldenström. Las crioglobulinemias de origen monoclonal, son generalmente debidas a IgM.

APARATAJE:

- Espectrofotómetro

REACTIVOS:
- Diluyente R1

- Anticuerpo R2

- Calibrador o Patrón: PROT CAL

- ClNa 9 g/L 

MUESTRA:
- Suero o plasma fresco, recogido con heparina o EDTA como anticoagulantes

MATERIAL:
- Pipetas automáticas de 100-1000 uL y de 10 uL

- Puntas amarillas y azules

- Gradilla
- Tubos de ensayo de 3 mL 

- Cubetas de espectrofotometría 
- Vaso desechos

PREPARACIÓN:

En primer lugar se realizan las diluciones del Calibrador PROT CAL en ClNa 9 g/L como diluyente. Para obtener las concentraciones de cada dilución de IgM, multiplicar la concentración de IgM del calibrador por el factor correspondiente indicado en la tabla:

PROCEDIMIENTO:

1. Calentar los reactivos y encender el espectrofotómetro.

2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.

3. Pipetear en una cubeta o tubo de ensayo:

- Reactivo R1 (Diluyente): 800 uL + Muestra o calibrador: 10 uL

4. Mezclar y medir la absorbancia (A1), después de la adición de la muestra.

5. Inmediatamente después, pipetear en la cubeta:

- Reactivo R2: 200 uL

6. Mezclar y leer la absorbancia (A2) exactamente después de 2 minutos de añadir el Reactivo R2.

7. Debemos calcular la diferencia de absorbancias (A2-A1) obtenidas por los distintos calibradores, y construir la curva de calibración de los valores obtenidos frente a las concentraciones de IgM de cada dilución del Calibrador. La concentración de IgM en la muestra se calcula por interpolación de su diferencia (A2-A1) en la curva de calibración.

8. Ahora en un tubo de ensayo: suero (10 uL) +  Reactivo R1 (800 uL)

9. Medir la absorbancia (A1)

10. Echar inmediatamente después Reactivo R2 (200 uL), y medir absorbancia (A2).

RESULTADO:

La concentración resultado del Calibrador es de 259 mg/dL

- A1 (muestra con suero): 0,319

- A2 (muestra con suero): 0,565

Restamos A2-A1: 0,246

Hacemos la curva de calibración con los datos obtenido de la tabla y extrapolamos nuestro resultado de la muestra con suero a la recta.

OBSERVACIONES:

- Debemos ser precisos en el pipeteo.

- Para medir la Absorbancia 2, debe ser inmediatamente antes de 2 minutos del pipeteo pues el resultado a medir puede variar.

PRÁCTICA 9: DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS FEBRILES

OBJETIVO:

Determinar si un suero problema posee anticuerpos frente a un antígeno determinado.

PRINCIPIO DEL MÉTODO:

Los Antígenos Bacterianos son una técnica de aglutinación en porta y tubo para la detección y semicuantificación de anticuerpos anti-Salmonella, Brucella y Proteus en suero humano. Los reactivos, suspensiones bacterianas, coloreadas y estandarizadas, aglutinan en presencia del anticuerpo homólogo correspondiente en las muestras ensayadas.

SIGNIFICADO CLÍNICO:

El diagnóstico de enfermedades febriles puede establecerse bien sea por el aislamiento del microorganismo en sangre, orina o heces o por la demostración del título de anticuerpos específicos, somáticos (O) y flagelares (H) en el suero del paciente. La determinación de estos anticuerpos forma las bases para el ensayo de Widal que establece que altos niveles de anticuerpos O y H superiores a 1/100 en suero, es indicativo de infección por estos microorganismos.

REACTIVOS:

- Brucella abortus 5mL (antígenos bacterianos)

- Brucella, CTR +, 1mL

- ClNa

MATERIAL:

- Pipeta de 5 uL y de 100-1000 uL 

- Puntas amarillas y azules

- Vaso de desechos

- Gradilla

- 6 tubos de 3 mL

- Vaso con ClNa

- Estufa a 37ºC

PROCEDIMIENTO:

Método de aglutinación en tubo

1. Preparar tubos tal como sigue:

2. Añadir una gota (50 uL) de antígeno a cada tubo.

3. Agitar e incubar los tubos a 37ºC durante 24 horas.

RESULTADO:
No pudimos observar la aglutinación, puesto que al dejarlo incubando más tiempo, los resultados se alteraron y no había aglutinación.

OBSERVACIONES:

- Un grupo utilizó Proteus y otro Brucella.

- Deben de hacerse alícuotas para el ClNa.

- Se realizó solamente el método de aglutinación en tubo.

PRÁCTICA 8: DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS ANTI-TREPONEMA PALLIDUM

OBJETIVO:

Determinar mediante el método cualitativo y semicuantitativo la existencia de aglutinación de anticuerpos anti-Treponema pallidum.

PRINCIPIO DEL MÉTODO:

Es una prueba de hemoaglutinación indirecta en microplaca para la detección cualitativa y semicuantitativa de anticuerpos específicos anti-Treponema pallidum en suero humano. Los hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con una solución antigénica de T.pallidum, aglutinan en presencia de anticuerpos anti-T.pallidum mostrando unos patrones de aglutinación característicos.

SIGNIFICADO CLÍNICO:

La sífilis es una enfermedad venérea provocada por la infección con T.pallidum. La transmisión del microorganismo se produce por contacto directo a través de una lesión productiva. El periodo de incubación es aproximadamente de 20 días y la enfermedad progresa a través de 3 fases distintas con sintomatología diferente. Los anticuerpos anti-Treponema aparecen a partir de la primera fase y pueden permanecer en un 85-90% de pacientes tratados a pesar de haber superado la enfermedad.

REACTIVOS:

- R1: Células Test (hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con antígenos de T.pallidum)

- R2: Células Control (suspensión estabilizada de hematíes de ave)

- R3: Diluyente (tampón fosfato, extracto de T.pallidum)

- Control + (suero inmune humano prediluido 1:20)

- Control - (suero de animal)

MATERIAL:

- Placas de microtitulación con fondo en "U"

- Pipetas de 20-200 uL

- Puntas amarillas

- Vaso de precipitados (desechos)

MUESTRAS:

- Suero fresco o plasma

PROCEDIMIENTO:

Método cualitativo

1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.

2. Pipetear en pocillos adyacentes de una placa de microtitulación:

- Muestra 1/20 o Controles (uL)               25           25

- Células Control (uL)                               75           --

- Células Test (uL)                                    --            75

3. Agitar suavemente la placa hasta la completa homogeneización de las mezclas.

4. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 45-60 min.

5. Examinar macroscópicamente los patrones de aglutinación de las células.

Método semicuantitativo

1. Realizar diluciones dobles a partir de la dilución 1:20 de la muestra en Diluyente.

2. Ensayar cada dilución con 25 uL de diluyente en cada pocillo (4 pocillos), y en el primer pocillo depositar 25 uL de muestra.

3. Al final de las diluciones depositar 75 uL de células test.

RESULTADOS:

- Si forma velo es positivo.

- Si forma anillo es negativo.

- Observamos en la primera fila, correspondiente al método cuantitativo, que el resultado sale positivo.

- En la fila de abajo, correspondiente al método semicuatitativo, la titulación sería 1/80.

OBSERVACIONES:

- No se puede dejar sin observar los resultados de la placa más de 30 minutos, pues los resultados salen erróneos.

- Realizamos en la primera fila de la placa el método cualitativo, y en la segunda fila el método semicuantitativo.