martes, 17 de diciembre de 2019

PRÁCTICA 12: INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO-EL PROCEDIMIENTO OUCHTERLONY

OBJETIVO:
El objetivo de este experimento es introducir los principios de las interacciones antígeno-anticuerpo usando el procedimiento Ouchterlony.

COMPONENTES para 10 grupos de estudiantes:
- A Antisuero (Anticuerpo) 4-8ºC
- B Suero total (Antígeno) 4-8ºC
- C Albúmina (Antígeno) 4-8ºC
- D IgG (Antígeno) 4-8ºC
- E Tampón en polvo: Tª ambiente
- 1 Agarosa: Tª ambiente
- 1 Tubo de solución de carga para practicar: Tª ambiente
- 40 tubos Microtest
- 40 Pipetas de transferencia
- 1 Plantilla para corte de pocillos (en el protocolo)
- 10 Cortadores para pocillos ("well cutters")
- 40 Placas de Petri



APARATAJE:
- Microondas
- Baño termostático
- Estufa de incubación

MATERIAL:
- Vaso de precipitados 500 mL
- Probeta 250 mL
- Varilla agitadora
- Papel parafilm
- 3 Placas por grupo
- Gradilla
- Pipetas automáticas 10-100 uL/ 1000-5000 uL
- Puntas amarillas y blancas
- Tubos eppendorf (alícuotas A, B, C y D)
- Pipeta Pasteur 
- Plantilla
- Cubetas
- Papel 



PROCEDIMIENTO:
A. PREPARACIÓN DE AGAROSA
1. En una vaso de precipitados de 500 mL, agregar todo el contenido del paquete de tampón en polvo (componente E) a 225 mL de agua destilada. Agitar para disolver totalmente el polvo.
2. Añadir todo el contenido del paquete de Agarosa UltraSpec al vaso de precipitados (3 gr). Agitar la suspensión para dispersar los grumos. 
3. Calentar la solución hasta ebullición para disolver la agarosa. Sacar del microondas cuando la solución final esté clara y transparente.
4. Enfriar la agarosa a 55ºC en un baño de agua. Agitar de vez en cuando.
5. Preparar alícuotas de 25 mL de la solución de agarosa (55ºC) para cada uno de los grupos.







B. PREPARACIÓN DE PLACAS DE OUCHTERLONY
1. Cada grupo necesitará 3 placas. Usar una micropipeta para pipetear 5000 uL (5 mL) de la agarosa líquida (enfriada a 55ºC) en cada placa.
2. Si contiene burbujas, agitar suavemente la placa para eliminarlas.
3. Permitir que la agarosa solidifique. Tardará aproximadamente 10-15 min, en cuyo momento el gel aparecerá un poco opaco.
4. Si las placas no se utilizan el mismo día, pueden envolverse con plástico y almacenarse invertidas en la nevera hasta dos semanas.




C. PREPARACIÓN DE POCILLOS PARA LAS MUESTRAS
1. Usar una pipeta Pasteur (cortada del tamaño de los pocillos de la plantilla) y una plantilla para realizar los pocillos. 
2. Cortar los cinco pocillos con un suave movimiento de perforación y aspiración. 
3. Repetir los pasos con las otras placas.







D. CARGA DE LAS MUESTRAS EN LOS POCILLOS
1. Anotar la identificación de cada grupo en la parte superior de la placa antes de cargar las muestras
2. Usando la misma pipeta, llenar los pocillos centrales de las tres placas con 30 uL de antisuero (anticuerpo) del tubo A. 
3. Llenar los pocillos externos con 30 uL de antígeno usando un a punta de pipeta limpia para cada antígeno de la siguiente manera:

Placa 1

Placa 2 


Placa 3





E. INCUBACIÓN
Colocar las tapas en las placas. Colocar con cuidado las placas cubiertas en la cámara de incubación sobre una capa de toallas de papel húmedas. No se deben invertir las placas. Cubrir la cámara con una envoltura de plástico y dejar incubar a temperatura ambiente entre 24 y 48 horas para permitir que se formen líneas de precipitación o la cámara se puede colocar en una estufa de incubación a 37ºC.



RESULTADOS:
Placa 1
Reacción de identidad.
Placa 2
Fue la única placa que no salió con el resultado esperado. Debería haber salido Reacción de identidad parcial.
Placa 3
Reacción de no identidad.


sábado, 30 de noviembre de 2019

PRÁCTICA 11: DETERMINACIÓN DEL TÍTULO ANTI-SLO

OBJETIVO:
El objetivo de está practica es la realización de una inhibición de la hemaglutinación para determinar el título de antiestreptolisina O.

PRINCIPIO:
El carácter inmunogénico de la SLO permite valorar la extensión de una infección estreptocócica, por simple titulación del nivel en suero de anticuerpos anti-SLO. Diluciones crecientes del suero problema se enfrentan con una cantidad constante de SLO, en presencia de una suspensión de hematíes, determinándose la dilución de suero más alta capaz de inhibir el poder hemofílico de la toxina. La inversa de dicha dilución corresponde al título del suero.

REACTIVOS:
- Tampón

- Suspensión de hematíes


- SLO


APARATAJE:
- Estufa de incubación

MATERIAL:
- Pipetas automáticas 50 uL/20-200uL
- Puntas amarillas
- Gradillas para Eppendorf
- Placa en forma de U
- Parafilm





MUESTRA:
- Suero 1/25

- Suero 1/10



PROCEDIMIENTO (MICROMÉTODO):
A) Diluciones del suero:
- Preparar las siguientes diluciones del suero del paciente:
0,2 ml suero+1,8 ml tampón (1:10)
0,1 ml suero+2,4 ml tampón (1:25)

A parir de aquí, proceder del siguiente modo:







RESULTADOS:
El título de antiestreptolisina O corresponde a la inversa de la mayor dilución en cuyo tubo no se detecta una hemólisis (velo).
- Hematíes debe aparecer libre de hemólisis (botón).
- Estreptolisina O debe presentar una hemólisis evidente.
- Fila A: El título sería 80.
- Fila B: El título sería 200.



miércoles, 20 de noviembre de 2019

PRÁCTICA 10: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE INMUNOGLOBULINA M (IgM)

OBJETIVO:
Cuantificar la IgM en suero o plasma humano por el método de inmunoturbidimetría. 

PRINCIPIO DEL MÉTODO:
Los anticuerpos anti-IgM forman compuestos insolubles cuando se combinan con la IgM de la muestra del paciente, ocasionando un cambio de absorbancia proporcional a la concentración de IgM en la muestra, y que puede ser cuantificada por comparación con un calibrador de IgM de concentración conocida.

SIGNIFICADO CLÍNICO:
La IgM es la única inmunoglobulina que sintetiza el recién nacido. En adultos representa el 5-10% del total de inmunoglobulina. Su estructura pentamérica y su elevado peso molecular evita su paso a espacios extravascuslares.
Su concentración se halla disminuida en enfermedades relacionadas con deficiencias hereditarias o adquiridas de la producción de inmunoglobulinas. 
La respuesta normal a las infecciones consiste en aumentar la producción de inmunoglobulina. La IgM generalmente aumenta en infecciones líricas e infecciones del torrente circulatorio como la malaria y la cirrosis biliar primaria. En caso de mieloma múltiple, si la paraproteína es una IgM probablemente se trata de una macroglobulinemia de Waldenström. Las crioglobulinemias de origen monoclonal, son generalmente debidas a IgM.

APARATAJE:
- Espectrofotómetro


REACTIVOS:
- Diluyente R1

- Anticuerpo R2

- Calibrador o Patrón: PROT CAL

- ClNa 9 g/L 


MUESTRA:
- Suero o plasma fresco, recogido con heparina o EDTA como anticoagulantes


MATERIAL:
- Pipetas automáticas de 100-1000 uL y de 10 uL

- Puntas amarillas y azules


- Gradilla
- Tubos de ensayo de 3 mL 

- Cubetas de espectrofotometría 
- Vaso desechos

PREPARACIÓN:
En primer lugar se realizan las diluciones del Calibrador PROT CAL en ClNa 9 g/L como diluyente. Para obtener las concentraciones de cada dilución de IgM, multiplicar la concentración de IgM del calibrador por el factor correspondiente indicado en la tabla:


PROCEDIMIENTO:
1. Calentar los reactivos y encender el espectrofotómetro.
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
3. Pipetear en una cubeta o tubo de ensayo:
- Reactivo R1 (Diluyente): 800 uL + Muestra o calibrador: 10 uL
4. Mezclar y medir la absorbancia (A1), después de la adición de la muestra.
5. Inmediatamente después, pipetear en la cubeta:
- Reactivo R2: 200 uL
6. Mezclar y leer la absorbancia (A2) exactamente después de 2 minutos de añadir el Reactivo R2.
7. Debemos calcular la diferencia de absorbancias (A2-A1) obtenidas por los distintos calibradores, y construir la curva de calibración de los valores obtenidos frente a las concentraciones de IgM de cada dilución del Calibrador. La concentración de IgM en la muestra se calcula por interpolación de su diferencia (A2-A1) en la curva de calibración.
8. Ahora en un tubo de ensayo: suero (10 uL) +  Reactivo R1 (800 uL)
9. Medir la absorbancia (A1)
10. Echar inmediatamente después Reactivo R2 (200 uL), y medir absorbancia (A2).





RESULTADO:


La concentración resultado del Calibrador es de 259 mg/dL
- A1 (muestra con suero): 0,319
- A2 (muestra con suero): 0,565
Restamos A2-A1: 0,246
Hacemos la curva de calibración con los datos obtenido de la tabla y extrapolamos nuestro resultado de la muestra con suero a la recta.

OBSERVACIONES:
- Debemos ser precisos en el pipeteo.
- Para medir la Absorbancia 2, debe ser inmediatamente antes de 2 minutos del pipeteo pues el resultado a medir puede variar.

PRÁCTICA 14: RUBEÓLA Ig G ELISA

OBJETIVO: Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de anticuerpos IgG contra vIrus de la rubéola en suero y plasma h...