CUADERNO DE PRÁCTICAS DE TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO: PRÁCTICA 12: INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO-EL PROCEDIMIENTO OUCHTERLONY

OBJETIVO:

El objetivo de este experimento es introducir los principios de las interacciones antígeno-anticuerpo usando el procedimiento Ouchterlony.

COMPONENTES para 10 grupos de estudiantes:

- A Antisuero (Anticuerpo) 4-8ºC

- B Suero total (Antígeno) 4-8ºC

- C Albúmina (Antígeno) 4-8ºC

- D IgG (Antígeno) 4-8ºC

- E Tampón en polvo: Tª ambiente

- 1 Agarosa: Tª ambiente

- 1 Tubo de solución de carga para practicar: Tª ambiente

- 40 tubos Microtest

- 40 Pipetas de transferencia

- 1 Plantilla para corte de pocillos (en el protocolo)

- 10 Cortadores para pocillos ("well cutters")

- 40 Placas de Petri

APARATAJE:

- Microondas

- Baño termostático

- Estufa de incubación

MATERIAL:

- Vaso de precipitados 500 mL

- Probeta 250 mL

- Varilla agitadora

- Papel parafilm

- 3 Placas por grupo

- Gradilla

- Pipetas automáticas 10-100 uL/ 1000-5000 uL

- Puntas amarillas y blancas

- Tubos eppendorf (alícuotas A, B, C y D)

- Pipeta Pasteur

- Plantilla

- Cubetas

- Papel

PROCEDIMIENTO:

A. PREPARACIÓN DE AGAROSA

1. En una vaso de precipitados de 500 mL, agregar todo el contenido del paquete de tampón en polvo (componente E) a 225 mL de agua destilada. Agitar para disolver totalmente el polvo.

2. Añadir todo el contenido del paquete de Agarosa UltraSpec al vaso de precipitados (3 gr). Agitar la suspensión para dispersar los grumos.

3. Calentar la solución hasta ebullición para disolver la agarosa. Sacar del microondas cuando la solución final esté clara y transparente.

4. Enfriar la agarosa a 55ºC en un baño de agua. Agitar de vez en cuando.

5. Preparar alícuotas de 25 mL de la solución de agarosa (55ºC) para cada uno de los grupos.

B. PREPARACIÓN DE PLACAS DE OUCHTERLONY

1. Cada grupo necesitará 3 placas. Usar una micropipeta para pipetear 5000 uL (5 mL) de la agarosa líquida (enfriada a 55ºC) en cada placa.

2. Si contiene burbujas, agitar suavemente la placa para eliminarlas.

3. Permitir que la agarosa solidifique. Tardará aproximadamente 10-15 min, en cuyo momento el gel aparecerá un poco opaco.

4. Si las placas no se utilizan el mismo día, pueden envolverse con plástico y almacenarse invertidas en la nevera hasta dos semanas.

C. PREPARACIÓN DE POCILLOS PARA LAS MUESTRAS

1. Usar una pipeta Pasteur (cortada del tamaño de los pocillos de la plantilla) y una plantilla para realizar los pocillos.

2. Cortar los cinco pocillos con un suave movimiento de perforación y aspiración.

3. Repetir los pasos con las otras placas.

D. CARGA DE LAS MUESTRAS EN LOS POCILLOS

1. Anotar la identificación de cada grupo en la parte superior de la placa antes de cargar las muestras

2. Usando la misma pipeta, llenar los pocillos centrales de las tres placas con 30 uL de antisuero (anticuerpo) del tubo A.

3. Llenar los pocillos externos con 30 uL de antígeno usando un a punta de pipeta limpia para cada antígeno de la siguiente manera:

Placa 1

Placa 2

Placa 3

E. INCUBACIÓN

Colocar las tapas en las placas. Colocar con cuidado las placas cubiertas en la cámara de incubación sobre una capa de toallas de papel húmedas. No se deben invertir las placas. Cubrir la cámara con una envoltura de plástico y dejar incubar a temperatura ambiente entre 24 y 48 horas para permitir que se formen líneas de precipitación o la cámara se puede colocar en una estufa de incubación a 37ºC.