PRÁCTICA 14: RUBEÓLA Ig G ELISA

OBJETIVO:

Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de anticuerpos IgG contra vIrus de la rubéola en suero y plasma humanos.

FUNDAMENTO:

El inmunoensayo enzimático sobre fase sólida (ELISA) está basado en el principio del sandwich. Los pocillos están recubiertos con un antígeno. Los anticuerpos específicos de la muestra que se unen a los pocillos recubiertos con el antígeno son detectados por un conjugado enzimático del segundo anticuerpo específico para el antígeno humano IgG. La intensidad del color desarrollado por la reacción del substrato es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos IgG detectados. Los resultados de las muestras se pueden determinar directamente usando la curva estándar.

MUESTRA:

Suero o plasma (diluir con el diluyente 1/101)

Diluyente

Rubeóla

Muestra diluida (rubéola+diluyente)

COMPONENTES DEL KIT:

- Microtiras de Ig G recubiertas de antígeno de rubeóla.

- Calibradores: suero humano diluido con PBS: a) 0 b) 10 c) 50 d) 200 e)500 U/I/mL (listos para usar)

- Conjugado de Ig G antihumano 15 mL anticuerpos Ig G de conejo (listos para usar)

- Sustrato (listos para usar)

- Solución de parada (listos para usar)

- Solución diluyente para la muestra

- Solución de lavado 10X

MATERIAL:

- Gradillas

- Pipeta automática 100 uL/1000 uL y de 5 uL

- Puntas amarillas y azules

- Papel de filtro
- Parafilm 

PROCEDIMIENTO:

Preparación de los reactivos (solución de lavado, diluir antes de usar 1/9 con agua destilada (9).

Técnica

1. Preparar un pocillo para sustrato blanco (poner al principio), 5 pocillos para los calibradores, pocillos para las muestras.

2. Pipetear 100 uL en cada pocillo de calibradores, y en el 7º pocillo colocar 100 uL de muestra (diluida 1/101). Dejar el 1º pocillo para el blanco.

3. Preparar muestra: echar en un eppendorf 500 uL de diluyente y 5 uL de muestra de rubéola.

POCILLO 1	POCILLO 2	POCILLO 3	POCILLO 4	POCILLO 5	POCILLO 6	POCILLO 7
Nada 0 UI/mL	Calibrador A	Calibrador B	Calibrador C	Calibrador D	Calibrador E	MUESTTRA 100 uL (1/101)

4. Tapar la placa e incubar a temperatura ambiente 1 hora.

5. Después de incubar, aspirar o volcar. Lavar 3 veces con 300 uL de solución de lavado.

6. Evitar rebosar los pocillos cuando lavamos y sin mezclar, usando puntas de pipeta diferentes.

7. Pipetear 100 uL de conjugado anti-Ig G con excepción del blanco. 

8. Tapar e incubar 30 minutos a temperatura ambiente.

9. Repetir el paso 4.

10. Pipetear 100 uL de sustrato en todos los pocillos, incluido el blanco.

11. Tapar e incubar 20 minutos en la oscuridad.

12. Pipetear 100 uL de solución de parada, incluir el blanco.

13. Medir la absorción a 450 o 620 nm. Es estable durante 60 minutos.

MEDICIÓN: Curva de calibración

1. Efectuar con el blanco del pocillo A1-A1 la calibración a 0 con el lector ELISA.

2. Medir la absorbancia a 450 0 620 nm, anotar los resultados de los controles y de la muestra (echar foto).

3. Si la calibración a 0 no es posible automáticamente, restar el valor del pocillo blanco al resto.

Cálculo del valor de la medición

Para obtener resultados de medidas internaciones/mL se realiza una curva de calibración, con la absorbancias en el eje Y y las concentraciones de los  calibradores en el eje X.

RESULTADO:

PRÁCTICA 13: IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR INMUNOELECTROFORESIS

OBJETIVO:

El objetivo de esta práctica es separar las proteínas contenidas en un suero e identificar en él la posible presencia de Albúmina e Ig G.

FUNDAMENTO:
La inmunoelectroforesis es una técnica de separación e identificación de sustancias (habitualmente proteínas) que atraviesa dos fases. Durante la primera fase, separamos las proteínas de la muestra mediante una electroforesis convencional en agarosa. En la segunda fase, se practica un carril o canal paralelo al recorrido electroforético y se rellena con un Ac antiproteína adecuado. La difusión del Ag (proteína) y del Ac (suero antiproteína) permitirá que ambos se unan y reaccionen entre sí formando un complejo Ag-Ac que se hará visible en forma de unos arcos de precipitación.

COMPONENTES DEL KIT:

- A: Ig G

- B: Suero sanguíneo

- C: Albúmina

- D: Anticuerpos frente al suero

- E: Anticuerpo frente a la Ig G

- F: Polvo de agarosa

- G: Tampón de electroforesis concentrado (25x)

- Papel de filtro

- Pajitas para perforar los pocillos

- Placas de Petri (6 cm de diámetro)

APARATAJE:

- Microondas
- Baño termostático

- Cubeta de electroforesis y fuente de alimentación

MATERIAL:

- Probeta 1000 mL

- Auxiliar de pipeteo

- Pipeta graduada 10 mL

- Matraz Erlenmeyer 500 mL

- Moldes fabricados con placa de Petri y portaobjetos

- Micropipeta de 50 uL

PROCEDIMIENTO:

Preparación del tampón y el gel de electroforesis

1. Prepara el tampón de electroforesis diluyendo 38 mL del bote que lo contiene en forma concentrada (componente G del kit) en 912 mL de agua destilada para obtener un volumen total de tampón de 950 mL. Este tampón se usará para preparar la agarosa y realizar la electroforesis.

2. Prepara la solución para el gel de agarosa siguiendo los pasos que se indican a continuación:

 a) Añade el contenido total del sobre que contiene la agarosa (componente F) en 100 mL del tampón de electroforesis obtenido en el paso anterior. Utiliza para ello un frasco erlenmeyer de 500 mL. Con un rotulador, marca el nivel alcanzado por el tampón.

 b) Pon un tapón de papel al frasco erlenmeyer y calienta la mezcla en el microondas hasta disolver el polvo de agarosa. Al final, la solución debe ser transparente (como agua) y no debe contener partículas sin disolver.

 c) Enfría la solución hasta 60ºC en un baño termostático. Si se ha producido una evaporación importante, añade agua destilada hasta el nivel marcado en pasos anteriores.

3. Construye un molde para los carriles utilizando una placa de Petri pequeña (6 cm de diámetro) y cuatro portaobjetos.

4. Pipetea la cantidad necesaria de gel de agarosa (80-100 mL) en la bandeja de la cubeta de electroforesis procurando que cubra el fondo uniformemente y no forme burbujas. Antes de que solidifique, introduce en el centro del gel el molde para los carriles, con la plantilla debajo.

5. Cuando el gel haya solidificado, extrae cuidadosamente el molde para los carriles y guarda el gel en cámara húmeda hasta el momento de su uso.

Realización de la electroforesis

1. Haz los pocillos en el gel con ayuda de la pajita o Pipeta Pasteur suministrada en el kit. Debes dejar 0,5 cm de distancia entre cada pocillo y los carriles contiguos. Elimina la agarosa de los pocillos con una aguja y otro elemento punzante y fino.

2. Coloca la bandeja con el gel en la cubeta de electroforesis y dispón papel de filtro en cada uno de sus extremos de manera que sobresalga hacia el exterior. Dicho papel deberá estar empapado en el tampón.

3. Vierte tampón en cada uno de los vasos de la cubeta de electroforesis hasta llenarlos y asegúrate de que el papel de filtro que sobresale de los extremos del gel de agarosa esté sumergido en el tampón. No cubras el gel con el tampón.

4. Dispensa 20 uL de cada Ag (A, B y C) en los pocillos correspondientes (A en el superior, B en el central y C en el inferior). Cambia las puntas de la pipeta entre Ag y Ag.

5. Cierra la tapa de la cubeta de electroforesis y conecta los electrodos respetando la polaridad y teniendo en cuenta que los Ag a identificar están cargados negativamente.

6. Conecta la cubeta a la fuente de alimentación y aplica un voltaje de 125 V durante 30-45 minutos. Comprueba que hay burbujas saliendo de los electrodos. Mantén la corriente eléctrica conectada hasta que el colorante que acompaña a las muestras se acerque al final del gel de agarosa.

7. Una vez finalizada la electroforesis, desconecta la fuente de alimentación y quita la tapa de la cubeta. Retira el papel de filtro y extrae de la cubeta la bandeja con el gel. Deposítalo en una superficie horizontal para proceder a la fase de difusión de Ag y Ac.

Difusión de los Ag y Ac

1. Añade 50 uL de cada Ac en el carril correspondiente. Dispensa el Ac procurando que se distribuya por todo el carril.

2. Coloca la bandeja con el gel en una cámara húmeda.

3. Tras 24-48 horas de difusión serán visibles los arcos de precipitación en el gel. 

RESULTADO:

Aparecerán curvas de albúmina y curvas de Ig G.